組織培養(yǎng)常遇到的問題-組培
發(fā)布日期：2023/01/12 13:55:31
1. 培養(yǎng)基配制注意事項
植物組織培養(yǎng)最常用MS培養(yǎng)基，包含十幾種化合物。有些化合物相遇會發(fā)生化學反應產生沉淀，影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，所以MS培養(yǎng)基需要配制多種高倍母液。
配制母液時，尤其涉及大量元素的母液時，一定要等一種成分溶解之后，再緩慢的添加另一種成分；切記一鍋煮，即不能將各種化合物一齊添加進去。
2. 滅菌后培養(yǎng)基不凝膠或者凝膠偏軟
植物凝膠、瓊脂都對酸性條件敏感，pH 值低于5很難成膠或凝膠偏軟，切記高壓滅菌前調節(jié)培養(yǎng)基 pH 值（5.5 - 6.0）。植物凝膠對二價陽離子濃度有要求，也就是相對于 MS 培養(yǎng)基，1 / 2 MS 培養(yǎng)基中植物凝膠要適當增加用量。
另外滅菌后，倒出培養(yǎng)基前一定將培養(yǎng)基搖勻（帶防燙手套），因為瓊脂密度大底層含量高，容易造成培養(yǎng)基強度不均勻。
3. 水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分，在使用過程中有無區(qū)別？
水解酪蛋白對胚狀體、不定芽的分化有良好的促進作用，通常用量在 500 mg/L，不管是酸解還是酶解，作用都是一樣的，酶解更有利于發(fā)揮其作用。
4. 怎么溶解組培常用植物激素？
IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等應先溶解于少量 95% 的乙醇中，再加水定容配制成母液。
如有結晶析出，可考慮用 1 / 10 體積的乙醇溶解后再定容；2，4 -D 易溶于堿性水溶液，可用少量 1mol/L 的 NaOH 溶液溶解后再慢慢加水定容；KT 和 6 -BA 先用少量的 HCL 溶解，再加水定容到一定的濃度。
5. 細胞分裂素使用濃度？
一般情況下在培養(yǎng)基中加入 0.1～10.0 mg/L 的細胞分裂素（6 -BA/KT/ZT)，多數(shù)用 1.0～2.0 mg/L，KT 濃度為 0.5～2 mg/L，濃度要根據實驗材料來調整。細胞分裂素可以單獨使用也可以與細胞生長素配合使用。
6. 哪些植物激素能高壓滅菌，哪些不能高壓滅菌？
IBA、NAA、6 -BA、2,4 -D 可高溫高壓滅菌。IAA、GA3、茉莉酸等不可高溫高壓滅菌，否則會分解失效，該類植物激素配制母液后需用 0.22 微孔濾膜過濾除菌，待培養(yǎng)基冷卻（50 - 60℃）后尚未凝膠前加入混勻。
7. 培養(yǎng)基的 pH 值會凝膠硬度有無影響？
有影響。
若將培養(yǎng)基 pH 值調的過高（大于 6），則培養(yǎng)基偏硬，增加接種的阻力，會對外植體造成損傷。
若將培養(yǎng)基 pH 值調的過低（小于 4.5），則培養(yǎng)基不能凝固，起不到固定外植體的作用。一般將培養(yǎng)基的 pH 調節(jié)至 5.5～6.0 為宜。
8. 滅菌過程是否影響培養(yǎng)基的 pH 值？
培養(yǎng)基中的蔗糖和激素在高溫滅菌過程中容易酸化，培養(yǎng)基 pH 值滅菌后會有所下降，滅菌前培養(yǎng)基的 pH 值偏低可能導致培養(yǎng)基不凝或偏軟。要求偏酸性的培養(yǎng)基可適當增加瓊脂或植物凝膠的用量。
9. 應用 75% 的酒精進行種子消毒的過程中需要注意哪些問題？
種子在消毒過程中使用 75% 的酒精應慎重，酒精滲透力極強，消毒時間過長會直接影響種子發(fā)芽率，所以建議消毒時間不應超過 1 min。
10. 原始繁殖材料的消毒
組培原始繁殖的外植體消毒，直接影響整個培養(yǎng)過程。
從室外采回來的外植體需進行消毒，首先用自來水沖洗外植體，沖洗時間可根據采集部位不同而定，一般在 5～15 分鐘即可；在超凈臺中進行藥劑的處理，常用的藥劑處理有 70% 的乙醇溶液、9% 的次氯酸鈉溶液和 0.1～0.2% 的升汞溶液，具體可根據實驗材料而定。應注意的是經升汞滅菌的外植體必須用無菌水沖洗 6～8 次。
11. 怎樣處理植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的各種污染？
植物組織培養(yǎng)過程中的污染來源主要分為 3 種：真菌、細菌、組織培養(yǎng)過程中的污染源
在操作過程中，難免有菌落入培養(yǎng)基或植物材料上導致污染。不正確操作也會增加污染幾率。
預防措施：通風、保持室內空氣干燥、紫外殺菌等。污染物品和污染培養(yǎng)基不要在培養(yǎng)室近距離開瓶洗刷。
污染原因判斷：
（1）培養(yǎng)基污染
若污染菌類是零星分散在培養(yǎng)基中，可確定是人為引起的污染。比如：培養(yǎng)基滅菌不徹底，開瓶時間過長，滅菌后存放時間過長，高溫蒸汽滅菌器的溫度、壓力、時間沒有正確設，過濾滅菌過程中濾膜孔徑選擇，過濾滅菌器的滅菌處理，過濾滅菌操作等。這些均會影響培養(yǎng)基的滅菌效果。
措施：嚴格按照實驗要求，滅菌規(guī)程操作。
（2）外植體污染
若污染菌類是從材料周圍長起，且發(fā)生在 5 天以后，則說明是材料帶的內生菌?？赡苁墙臃N用具滅菌不徹底，接種時材料被污染；
若從培養(yǎng)基以下開始長菌，發(fā)生時間較早，且有從里向外的趨勢，則說明是切口引起的污染，原因可能是未剪去兩個切口或者雖剪去切口但是所用器具帶菌；或者是未及時發(fā)現(xiàn)污染苗，接種過程中引起交叉污染；
措施：取材時應仔細選擇，以減少污染的發(fā)生。
（3）操作環(huán)節(jié)污染
接種室是否清潔、干燥、密封，是否經常用紫外燈照射、甲醛熏蒸、70% 的酒精噴霧殺菌等；超凈工作臺擺放物品雜亂，長時間不換濾網，導致凈化能力降低；接種用具滅菌不徹底引起污染；操作不正確等。
措施：每次接種前半個小時，用 20% 的新潔爾擦洗室內設備、工作臺面，再用紫外燈照射 20 min，噴灑 70% 的乙醇進行消毒。除了培養(yǎng)基、接種材料、器具和用具保證無菌外，同時在接種時還需要嚴格進行無菌操作。
措施：
（1）真菌污染后，如果已形成孢子，則必須經高壓滅菌后扔掉；若是細菌污染，只要及時發(fā)現(xiàn)，將材料上部未感染菌的部分剪下轉接，材料仍可以用。
（2）用抗生素等殺菌藥劑處理。至今還未發(fā)現(xiàn)哪種抗生素能夠對各種菌都有效，并且常影響植物材料的正常生長分化。另一些藥劑，雖有的殺菌效果好，但往往容易引起鹽害，也無法利用。
12. 外植體的選擇
為了使接種后的誘導得以成功，選擇的外植體應該是幼嫩、處于生長旺盛時期的，選擇的外植體的體積不能過小，如若過小則會影響愈傷組織的形成，從而影響進一步的分化。因此，一般接種的外植體體積在 0.5～1.0 cm2 的范圍內即可。最適的為莖尖、帶芽、莖段，也可以利用葉子、子葉、根段、花器官組織等。
13. 植物莖段組織培養(yǎng)需要注意哪些問題
以莖段進行組織培養(yǎng)比較容易，一般取植物的嫩莖切段作為外植體，切成 0.5～1 cm 長的小段進行接種，保證每個莖段有一個芽點和一片葉子，將芽點部位以下垂直插入培養(yǎng)基凝膠中進行生根培養(yǎng)。
植物組織培養(yǎng)最常用MS培養(yǎng)基，包含十幾種化合物。有些化合物相遇會發(fā)生化學反應產生沉淀，影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，所以MS培養(yǎng)基需要配制多種高倍母液。
配制母液時，尤其涉及大量元素的母液時，一定要等一種成分溶解之后，再緩慢的添加另一種成分；切記一鍋煮，即不能將各種化合物一齊添加進去。
2. 滅菌后培養(yǎng)基不凝膠或者凝膠偏軟
植物凝膠、瓊脂都對酸性條件敏感，pH 值低于5很難成膠或凝膠偏軟，切記高壓滅菌前調節(jié)培養(yǎng)基 pH 值（5.5 - 6.0）。植物凝膠對二價陽離子濃度有要求，也就是相對于 MS 培養(yǎng)基，1 / 2 MS 培養(yǎng)基中植物凝膠要適當增加用量。
另外滅菌后，倒出培養(yǎng)基前一定將培養(yǎng)基搖勻（帶防燙手套），因為瓊脂密度大底層含量高，容易造成培養(yǎng)基強度不均勻。
3. 水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分，在使用過程中有無區(qū)別？
水解酪蛋白對胚狀體、不定芽的分化有良好的促進作用，通常用量在 500 mg/L，不管是酸解還是酶解，作用都是一樣的，酶解更有利于發(fā)揮其作用。
4. 怎么溶解組培常用植物激素？
IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等應先溶解于少量 95% 的乙醇中，再加水定容配制成母液。
如有結晶析出，可考慮用 1 / 10 體積的乙醇溶解后再定容；2，4 -D 易溶于堿性水溶液，可用少量 1mol/L 的 NaOH 溶液溶解后再慢慢加水定容；KT 和 6 -BA 先用少量的 HCL 溶解，再加水定容到一定的濃度。
5. 細胞分裂素使用濃度？
一般情況下在培養(yǎng)基中加入 0.1～10.0 mg/L 的細胞分裂素（6 -BA/KT/ZT)，多數(shù)用 1.0～2.0 mg/L，KT 濃度為 0.5～2 mg/L，濃度要根據實驗材料來調整。細胞分裂素可以單獨使用也可以與細胞生長素配合使用。
6. 哪些植物激素能高壓滅菌，哪些不能高壓滅菌？
IBA、NAA、6 -BA、2,4 -D 可高溫高壓滅菌。IAA、GA3、茉莉酸等不可高溫高壓滅菌，否則會分解失效，該類植物激素配制母液后需用 0.22 微孔濾膜過濾除菌，待培養(yǎng)基冷卻（50 - 60℃）后尚未凝膠前加入混勻。
7. 培養(yǎng)基的 pH 值會凝膠硬度有無影響？
有影響。
若將培養(yǎng)基 pH 值調的過高（大于 6），則培養(yǎng)基偏硬，增加接種的阻力，會對外植體造成損傷。
若將培養(yǎng)基 pH 值調的過低（小于 4.5），則培養(yǎng)基不能凝固，起不到固定外植體的作用。一般將培養(yǎng)基的 pH 調節(jié)至 5.5～6.0 為宜。
8. 滅菌過程是否影響培養(yǎng)基的 pH 值？
培養(yǎng)基中的蔗糖和激素在高溫滅菌過程中容易酸化，培養(yǎng)基 pH 值滅菌后會有所下降，滅菌前培養(yǎng)基的 pH 值偏低可能導致培養(yǎng)基不凝或偏軟。要求偏酸性的培養(yǎng)基可適當增加瓊脂或植物凝膠的用量。
9. 應用 75% 的酒精進行種子消毒的過程中需要注意哪些問題？
種子在消毒過程中使用 75% 的酒精應慎重，酒精滲透力極強，消毒時間過長會直接影響種子發(fā)芽率，所以建議消毒時間不應超過 1 min。
10. 原始繁殖材料的消毒
組培原始繁殖的外植體消毒，直接影響整個培養(yǎng)過程。
從室外采回來的外植體需進行消毒，首先用自來水沖洗外植體，沖洗時間可根據采集部位不同而定，一般在 5～15 分鐘即可；在超凈臺中進行藥劑的處理，常用的藥劑處理有 70% 的乙醇溶液、9% 的次氯酸鈉溶液和 0.1～0.2% 的升汞溶液，具體可根據實驗材料而定。應注意的是經升汞滅菌的外植體必須用無菌水沖洗 6～8 次。
11. 怎樣處理植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的各種污染？
植物組織培養(yǎng)過程中的污染來源主要分為 3 種：真菌、細菌、組織培養(yǎng)過程中的污染源
在操作過程中，難免有菌落入培養(yǎng)基或植物材料上導致污染。不正確操作也會增加污染幾率。
預防措施：通風、保持室內空氣干燥、紫外殺菌等。污染物品和污染培養(yǎng)基不要在培養(yǎng)室近距離開瓶洗刷。
污染原因判斷：
（1）培養(yǎng)基污染
若污染菌類是零星分散在培養(yǎng)基中，可確定是人為引起的污染。比如：培養(yǎng)基滅菌不徹底，開瓶時間過長，滅菌后存放時間過長，高溫蒸汽滅菌器的溫度、壓力、時間沒有正確設，過濾滅菌過程中濾膜孔徑選擇，過濾滅菌器的滅菌處理，過濾滅菌操作等。這些均會影響培養(yǎng)基的滅菌效果。
措施：嚴格按照實驗要求，滅菌規(guī)程操作。
（2）外植體污染
若污染菌類是從材料周圍長起，且發(fā)生在 5 天以后，則說明是材料帶的內生菌?？赡苁墙臃N用具滅菌不徹底，接種時材料被污染；
若從培養(yǎng)基以下開始長菌，發(fā)生時間較早，且有從里向外的趨勢，則說明是切口引起的污染，原因可能是未剪去兩個切口或者雖剪去切口但是所用器具帶菌；或者是未及時發(fā)現(xiàn)污染苗，接種過程中引起交叉污染；
措施：取材時應仔細選擇，以減少污染的發(fā)生。
（3）操作環(huán)節(jié)污染
接種室是否清潔、干燥、密封，是否經常用紫外燈照射、甲醛熏蒸、70% 的酒精噴霧殺菌等；超凈工作臺擺放物品雜亂，長時間不換濾網，導致凈化能力降低；接種用具滅菌不徹底引起污染；操作不正確等。
措施：每次接種前半個小時，用 20% 的新潔爾擦洗室內設備、工作臺面，再用紫外燈照射 20 min，噴灑 70% 的乙醇進行消毒。除了培養(yǎng)基、接種材料、器具和用具保證無菌外，同時在接種時還需要嚴格進行無菌操作。
措施：
（1）真菌污染后，如果已形成孢子，則必須經高壓滅菌后扔掉；若是細菌污染，只要及時發(fā)現(xiàn)，將材料上部未感染菌的部分剪下轉接，材料仍可以用。
（2）用抗生素等殺菌藥劑處理。至今還未發(fā)現(xiàn)哪種抗生素能夠對各種菌都有效，并且常影響植物材料的正常生長分化。另一些藥劑，雖有的殺菌效果好，但往往容易引起鹽害，也無法利用。
12. 外植體的選擇
為了使接種后的誘導得以成功，選擇的外植體應該是幼嫩、處于生長旺盛時期的，選擇的外植體的體積不能過小，如若過小則會影響愈傷組織的形成，從而影響進一步的分化。因此，一般接種的外植體體積在 0.5～1.0 cm2 的范圍內即可。最適的為莖尖、帶芽、莖段，也可以利用葉子、子葉、根段、花器官組織等。
13. 植物莖段組織培養(yǎng)需要注意哪些問題
以莖段進行組織培養(yǎng)比較容易，一般取植物的嫩莖切段作為外植體，切成 0.5～1 cm 長的小段進行接種，保證每個莖段有一個芽點和一片葉子，將芽點部位以下垂直插入培養(yǎng)基凝膠中進行生根培養(yǎng)。
