組織培養(yǎng)的條件和培養(yǎng)基制備注意事項
植物組織培養(yǎng)的條件
1、植物組織培養(yǎng)的整個操作和培養(yǎng)過程都要求在嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行，無菌是組織培養(yǎng)成功的首要條件。操作過程在接種室內(nèi)超凈工作臺上進(jìn)行;外植體材料要進(jìn)行表面消毒;配制的培養(yǎng)基要進(jìn)行高壓滅菌消毒。
2、溫度處理操作和培養(yǎng)過程都是在恒溫條件下進(jìn)行，一般在23—27℃之間，熱帶植物可偏高些，脫毒植物需要高溫處理。
3、光照處理植物的器官必須有光，某些植物器官的生成是在無光條件下，但它的生長和發(fā)育必須有光。莖尖的生長及試管苗的繼代增殖以3000-5000lux光照強(qiáng)度適宜;生根試管苗以3000lux適宜。光質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、器官的分化有不同的影響。光周期誘導(dǎo)一般是16h，黑暗是12h，對光周期敏感植物要掌握光照時間，否則影響植物的分化。
4、培養(yǎng)基的酸堿度因植物的種類不同而有區(qū)別，大多數(shù)植物要求在5.8之間，喜酸性培養(yǎng)的植物要求的酸堿度較嚴(yán)格。
培養(yǎng)基的成分
1、用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基迄今不下幾十種。歸納起來，任何一種培養(yǎng)基均有以下幾部分組成：無機(jī)鹽(大量元素、微量元素)，有機(jī)化合物(蔗糖、維生素類、氨基酸、核酸及其他水解化合物)，鐵鹽螯合劑，植物激素。
植物激素的純度對于組織培養(yǎng)的成功至關(guān)重要。接種的外植體，其分化速度(長芽)和分化方向(長根)，均取決于所加激素的種類、數(shù)量及比例。簡言之，主要是生長素和細(xì)胞分裂素的加入量以及兩者的比例。一般生長素類包括吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸;細(xì)胞分裂素類包括激動素、芐基氨基嘌呤、二甲基丙烯氨基嘌呤。
培養(yǎng)基中的糖類主要是蔗糖，少數(shù)情況下使用葡萄糖。大量生產(chǎn)可使用蔗糖。糖在培養(yǎng)基中的作用是提供碳源，同時用于維持滲透平衡，瓊脂是固體培養(yǎng)基中的成分，作為固化劑支持。培養(yǎng)物在培養(yǎng)基的成本消耗中，瓊脂占有相當(dāng)大的比例，培養(yǎng)基中瓊脂的加入量一般為4-7g。
2、在組織培養(yǎng)生產(chǎn)中，培養(yǎng)基的制備對母液的需求量相當(dāng)大，需一批一批地連續(xù)配制。為簡化配制過程，提高工作效率，一般將各種所需藥品先配制成高濃度溶液，貯備起來。到配制培養(yǎng)基時，按要求的濃度取一定量稀釋即可;我們稱這些高濃度的溶液為貯備液，習(xí)慣上稱母液。
制備母液時，先將所有藥品分成幾組，每組藥品制成一種母液。分組的原則是同組藥品混合溶解時不會發(fā)生質(zhì)的變化，也不產(chǎn)生沉淀。一般將藥品分成5組：大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)化合物類和植物激素。其中植物激素母液有若干種，每種激素都先制成1mg/ml的溶液。
母液制備注意事項
1、藥品稱量要盡可能準(zhǔn)確。大量元素用百分之一(千分之一)天平稱取，而微量元素、有機(jī)物類、植物激素等，則必須使用萬分之一的天平。
2、母液配制完畢注入試劑瓶后，一定要標(biāo)明母液的名稱、序號、濃度和配制日期等。
3、配制好的母液應(yīng)放置在冷藏箱內(nèi)保存，尤其是有機(jī)物和激素類。
培養(yǎng)基的配制
1、將用于配制培養(yǎng)基的容器洗凈，加入培養(yǎng)基總量四分之三的蒸餾水，放入所需的瓊脂和糖，然后加熱溶解。在加熱過程中應(yīng)不斷地攪拌，以避免瓊脂粘鍋或溢出。
2、待瓊脂和糖完全溶解后，按順序加入各貯備液以及所需的植物激素。
3、用蒸餾水定容補(bǔ)充由于加熱蒸發(fā)所損失的體積。
4、用蒸餾水調(diào)整pH。
5、通過漏斗或下口杯將培養(yǎng)基注入組組織培養(yǎng)容器內(nèi)，注入量為瓶容積的十分之一左右。灌裝要迅速，盡可能避免培養(yǎng)基粘在瓶壁上，且應(yīng)在培養(yǎng)基未冷卻之前灌裝完畢。
6、用封口膜或含透氣膜的塑料蓋將瓶口或試管口封嚴(yán)。
7、將封裝好的組織培養(yǎng)容器碼放在高壓滅菌鍋內(nèi)。于105Pa壓力、121℃下滅菌20分鐘。如使用小型手提式滅菌鍋時，一定要注意，當(dāng)鍋內(nèi)壓力上升時，先反復(fù)放氣數(shù)次，將鍋內(nèi)空氣排盡以后，再計算時間，否則達(dá)不到高壓滅菌的效果。
8、對于一些受熱易于分解的物質(zhì)，如維生素類，可采取先過濾滅菌的方法。待培養(yǎng)基滅菌后，尚未冷卻之前(40℃左右)加入并搖勻。經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)基可在室溫下存放3-5天，或在冷藏箱內(nèi)存放10天左右，最好在短時間內(nèi)用完。
